Elettroforesi delle proteine e western blot
Elettroforesi delle proteine e western blot sono due passaggi consecutivi dello stesso flusso: la corsa separa le proteine di un estratto in base al peso molecolare o al punto isoelettrico, il blot le trasferisce su membrana e le rende accessibili a un anticorpo. I reagenti che servono a percorrerlo — tamponi di lisi, sistemi di dosaggio, matrici di separazione, coloranti, marker, membrane e bloccanti — provengono nel catalogo CABRU da G Biosciences e FineTest: G Biosciences è presente con 6.604 referenze complessive, di cui 210 riconducibili a elettroforesi e blotting e 190 organizzate in kit.
I punti in cui si decide l'esito
Quasi tutti gli insuccessi di un western blot nascono da scelte fatte prima della membrana. Il tampone di lisi determina che cosa si estrae e vincola il metodo di dosaggio; la percentuale di gel decide se la banda attesa cade nella zona risolta; la membrana e il bloccante decidono quanto fondo si porta in fase di rivelazione. Sono decisioni indipendenti dall'anticorpo, e vale la pena prenderle prima di metterne in discussione uno.
| Punto di scelta | Opzioni | Come si decide |
|---|---|---|
| Dosaggio della proteina | Bradford, BCA | Bradford non tollera i detergenti; BCA risente di agenti riducenti e chelanti. Comanda il tampone di lisi |
| Percentuale di gel | Da 7,5% a 15%, o gradiente | Percentuali alte risolvono le proteine piccole, basse quelle grandi; il gradiente copre un intervallo ampio |
| Membrana | Nitrocellulosa, PVDF | La PVDF va pre-bagnata in metanolo e lega più proteina; la nitrocellulosa è pronta all'uso ma più fragile |
| Agente bloccante | Latte scremato, BSA, bloccanti privi di proteine | Il latte contiene caseina fosforilata: non si usa con anticorpi anti-fosfo |
| Marker di peso | Precolorato, non colorato | Il precolorato si segue durante corsa e trasferimento; il non colorato dà la stima di peso più accurata |
1D e 2D: quando serve la seconda dimensione
La SDS-PAGE monodimensionale separa solo per massa: proteine di peso simile ma carica diversa finiscono nella stessa banda. La bidimensionale antepone una focalizzazione isoelettrica, così la prima dimensione separa per punto isoelettrico e la seconda per massa; è il modo per distinguere isoforme e proteine con modificazioni post-traduzionali che spostano la carica, come le forme fosforilate. Il costo è un protocollo più lungo, più sensibile alla qualità del campione e a sali, detergenti ionici e acidi nucleici, che vanno rimossi prima della focalizzazione.
Che cosa trovi in catalogo
Nella gamma G Biosciences 120 referenze riguardano blotting e membrane, 114 matrici di agarosio per elettroforesi, 73 coloranti — 8 dei quali a base di Coomassie — 53 reagenti di estrazione e lisi, 44 sistemi di dosaggio proteico, 12 formulazioni di acrilammide e 6 fra ladder e marker, di cui uno di peso molecolare per proteine, precolorato. L'elenco completo, con codici e formati, si consulta nel catalogo prodotti filtrando per azienda. Quando una referenza non compare in elenco, se ne verifica l'esistenza presso il produttore.