Emostasi e coagulazione: plasmi, fattori purificati e reagenti per il dosaggio

L'emostasi è l'insieme dei meccanismi che arrestano la perdita di sangue da un vaso leso e ne mantengono la pervietà. Si articola in tre fasi: l'emostasi primaria, che porta all'adesione e all'aggregazione delle piastrine attraverso il fattore di von Willebrand; la coagulazione, una cascata di proteasi a serina che culmina nella generazione di trombina e nella conversione del fibrinogeno in fibrina; e la fibrinolisi, che dissolve il coagulo per opera della plasmina. Vi si oppongono gli anticoagulanti naturali — antitrombina, proteina C, proteina S, TFPI — il cui difetto sposta l'equilibrio verso la trombosi. In laboratorio si studia con test globali sul tempo di coagulazione, dosaggi di singolo fattore, saggi antigenici e generazione di trombina: ogni approccio richiede materiali di riferimento diversi.

Perché un dosaggio di fattore ha bisogno di un plasma carente?

Il dosaggio one-stage misura quanto il plasma in esame corregge il tempo di coagulazione prolungato di un plasma privo del fattore di interesse, confrontandolo con un calibratore. Il plasma carente funziona quindi da substrato: deve contenere tutti gli altri fattori a concentrazione normale e il fattore misurato a livello trascurabile, convenzionalmente inferiore a 1 UI/dl. Se il residuo è più alto, la curva si appiattisce e i campioni gravemente carenti non si distinguono fra loro.

I plasmi carenti si ottengono da soggetti con deficit congenito grave oppure per immunodeplezione, con l'assorbimento selettivo del fattore da un pool normale. Le due origini si comportano in modo confrontabile come substrato; cambiano disponibilità, contenuto residuo delle proteine associate — nel plasma carente di fattore VIII, la presenza o l'assenza di fattore di von Willebrand — e formato, congelato o liofilizzato.

Quali materiali servono, e per quale test

La scelta del materiale segue il tipo di informazione cercata: attività funzionale, quantità di antigene, presenza di un inibitore o controllo di qualità del sistema analitico.

Come si misura un inibitore del fattore VIII?

Quando un paziente sviluppa un anticorpo che neutralizza il fattore VIII, l'attività non si misura più con il solo dosaggio one-stage: serve il saggio di Bethesda. Diluizioni del plasma in esame vengono incubate due ore a 37 °C con una quantità nota di fattore VIII in plasma normale, e si misura l'attività residua. Un'unità Bethesda è definita come la quantità di inibitore che lascia il 50% dell'attività residua nella miscela di prova. La modifica di Nijmegen, introdotta nel 1995, tampona il plasma normale con imidazolo a pH 7,4 e usa plasma carente di fattore VIII immunodepleto per le diluizioni: standardizzando pH e concentrazione proteica migliora la discriminazione fra campioni positivi e negativi. I plasmi con inibitore a titolo lieve, moderato o severo servono come materiale di controllo del saggio.

Proteine purificate, substrati e attivatori

Accanto ai plasmi, i sistemi definiti si costruiscono con proteine purificate: protrombina, trombina, fattori VII, IX, X, XI, XII e XIII, proteina C, antitrombina, plasminogeno e fibrinogeno depletato di plasminogeno. A queste si affiancano gli attivatori e gli inibitori di uso corrente: il veleno di vipera di Russell, che attiva il fattore X ed è alla base del test dRVVT per il lupus anticoagulante, e l'inibitore della tripsina di mais (CTI), che blocca il fattore XIIa e sopprime l'attivazione da contatto nei saggi di generazione di trombina. Le versioni animali — bovina, murina, di coniglio, suina, canina — servono nei modelli sperimentali.

Plasmi e fattori a catalogo

Le referenze qui sotto provengono da Affinity Biologicals ed Enzyme Research Laboratories. L'elenco è parziale: la gamma completa di plasmi carenti, plasmi con inibitore, controlli e coppie di anticorpi si consulta nel catalogo prodotti e nella categoria plasmi carenti e di controllo. L'uso previsto di ciascuna referenza è quello dichiarato dal produttore nella propria documentazione.

Per la referenza adatta al fattore o al test di interesse è sufficiente indicare il codice o l'analita e scrivere a CABRU.