Terreni di coltura cromogenici: come funzionano e quando si usano

I terreni cromogenici sono terreni di coltura selettivi che contengono substrati sintetici formati da uno zucchero legato a un cromoforo incolore. Quando un enzima del microrganismo cercato idrolizza il legame, il cromoforo si libera, precipita dentro la colonia e le dà un colore stabile. Il substrato più diffuso è un indolile alogenato: il 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronide, o X-glucuronide, viene scisso dalla β-glucuronidasi di Escherichia coli e su TBX produce colonie blu-verdi, mentre su CCA lo stesso enzima le colora di blu scuro-violetto. In un terreno tradizionale la colonia si riconosce dalla morfologia e va poi confermata con prove biochimiche; il terreno cromogenico anticipa l'identificazione presuntiva alla piastra primaria, perché si legge il colore e non la forma: meno passaggi di conferma, e una lettura meno dipendente dall'esperienza dell'operatore.

Come si legge il colore di una colonia?

Il colore dipende da quale enzima è presente e da quale substrato contiene il terreno. Su Chromogenic Coliforms Agar (CCA) convivono due substrati: la β-D-galattosidasi, comune a tutti i coliformi, scinde il Salmon-GAL e colora le colonie di rosa-rosso; la β-D-glucuronidasi, tipica di E. coli, scinde l'X-glucuronide e le colora di blu scuro-violetto. Una colonia che esprime entrambi gli enzimi somma i due precipitati. La ISO 9308-1 chiede però un passaggio in più: le colonie rosa-rosse si contano fra i coliformi solo se ossidasi negative — così si escludono le Aeromonas spp. — insieme a tutte le blu scuro-violetto.

Altri terreni combinano il substrato cromogeno con una reazione di torbidità. Su Listeria Chromogenic Agar secondo Ottaviani e Agosti (ALOA) la β-glucosidasi, presente in tutto il genere Listeria, rende blu-verde ogni colonia; la fosfolipasi C fosfatidilinositolo-specifica (PI-PLC), che producono soltanto L. monocytogenes e L. ivanovii, idrolizza il fosfatidilinositolo del terreno e circonda la colonia di un alone opaco. Blu-verde con alone opaco significa presuntivo L. monocytogenes, e presuntivo soltanto: la ISO 11290-1 avverte nello stesso punto che anche L. ivanovii dà colonie blu-verdi con alone opaco. Blu-verde senza alone, un'altra Listeria.

Quali metodi ISO prescrivono un terreno cromogenico?

I metodi orizzontali ISO per la microbiologia della catena alimentare e per la qualità dell'acqua indicano il terreno cromogenico nel testo normativo. La tabella riassume i casi più frequenti nei laboratori di controllo.

Che cosa un terreno cromogenico non risolve

Il colore dà un'identificazione presuntiva, non una conferma: il metodo normativo decide se e come confermare la colonia. Ci sono poi limiti biologici precisi. Su CCA i ceppi di E. coli β-D-glucuronidasi negativi, come E. coli O157, non virano al blu e finiscono contati fra i coliformi. Gli enzimi non sono nemmeno esclusivi: qualche ceppo di Shigella dà su CCA colonie azzurro chiaro, e su ALOA sono stati descritti 64 isolati non-Listeria, di 12 specie in 7 generi, che crescono blu-verdi. Per questo la ISO 11290-1 prescrive due terreni solidi selettivi di principio diverso; ALOA da solo resta nella parte 2, di conta. Contano infine le condizioni di prova: ISO 16649-2 prevede (44 ± 1) °C per 18-24 h, ISO 9308-1:2014/Amd 1:2016 prevede (36 ± 2) °C per 21-24 h. Fuori da lì la resa del cromogeno e la selettività non sono quelle validate.

Come si controlla la qualità di un terreno cromogenico?

Il riferimento è la ISO 11133:2014 + Amd 1:2018 + Amd 2:2020, che descrive preparazione, produzione, conservazione e prove di prestazione dei terreni per alimenti, mangimi e acqua. Le prove richieste sono tre: produttività sul ceppo bersaglio rispetto a un riferimento non selettivo, selettività verso la flora non bersaglio, specificità della reazione cromogena. Con un terreno pronto all'uso il produttore esegue le prove di lotto e le documenta nel certificato di analisi, e il laboratorio non le ripete: a condizione che il produttore operi in un sistema qualità certificato e che trasporto e conservazione siano stati rispettati. Restano comunque suoi la qualifica del fornitore, il controllo in accettazione, la verifica del certificato e la gestione di stoccaggio e shelf-life. Con un disidratato ricostituito in laboratorio, la prova di prestazione sul lotto preparato ricade su chi lo prepara.

Terreni cromogenici a catalogo

Le referenze qui sotto sono terreni cromogenici Condalab a catalogo CABRU, in formato disidratato. La gamma comprende anche piastre pronte all'uso, flaconi e supplementi selettivi: l'elenco completo è nel catalogo prodotti e nella categoria terreni di coltura per microbiologia.

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