Eicosanoidi: cosa sono e come si studiano

Gli eicosanoidi sono mediatori lipidici derivati dagli acidi grassi polinsaturi, in particolare dall'acido arachidonico. Comprendono prostaglandine, trombossani, leucotrieni e lipossine, ai quali si affiancano gli endocannabinoidi e altri lipidi bioattivi. Non sono immagazzinati nella cellula: vengono prodotti al momento, a partire dall'acido arachidonico che la fosfolipasi A2 citosolica libera dai fosfolipidi di membrana quando la cellula riceve uno stimolo. Agiscono in modo autocrino e paracrino su recettori di superficie, hanno emivita da secondi a minuti e regolano infiammazione, aggregazione piastrinica, tono vascolare e numerose vie di segnalazione cellulare. Sono al tempo stesso bersagli farmacologici — le ciclossigenasi sono il bersaglio dei FANS — e biomarcatori nella ricerca su infiammazione, dolore, oncologia e malattie cardiovascolari e metaboliche.

Da dove viene un eicosanoide: le tre vie dell'acido arachidonico

Una volta liberato, l'acido arachidonico può imboccare tre percorsi enzimatici distinti. La via delle ciclossigenasi (COX-1 e COX-2) lo converte nell'endoperossido instabile PGH2, da cui sintasi specifiche ricavano prostaglandina E2, D2 e F2α, prostaciclina (PGI2) e trombossano A2. La via delle lipossigenasi produce, attraverso la 5-LOX e la proteina accessoria FLAP, il leucotriene A4 e da questo il leucotriene B4 e i cisteinil-leucotrieni; le lipossigenasi 12 e 15 generano invece gli acidi idrossieicosatetraenoici (HETE) e, per azione sequenziale di più lipossigenasi, le lipossine. La terza via è quella dei citocromi P450, che produce acidi epossieicosatrienoici (EET) e 20-HETE. Accanto a queste esiste una via non enzimatica: la perossidazione radicalica dell'acido arachidonico genera gli isoprostani.

Perché si dosano i metaboliti stabili e non i mediatori

Alcuni eicosanoidi sono troppo instabili per essere misurati direttamente. Il trombossano A2 si idrolizza spontaneamente con un'emivita di circa 30 secondi nel trombossano B2, biologicamente inattivo; la prostaciclina, con un'emivita di circa 2 minuti a pH e temperatura fisiologici, si idrolizza nella 6-keto prostaglandina F1α. In entrambi i casi si misura il prodotto stabile e si risale all'attività della via. La conseguenza pratica è che il prelievo va progettato per non generare in vitro ciò che si vuole misurare: un'attivazione piastrinica accidentale durante il prelievo produce trombossano che nel paziente non c'era.

ELISA o LC-MS/MS?

Le due tecniche rispondono a domande diverse. Il saggio immunoenzimatico competitivo misura un singolo analita per piastra, richiede volumi ridotti, non ha bisogno di strumentazione dedicata ed è la scelta abituale quando servono molti campioni su un bersaglio noto; il limite è la reattività crociata dell'anticorpo con metaboliti di struttura simile, che va valutata sui dati del produttore. La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem misura decine di ossilipine nella stessa corsa, distingue gli isomeri e quantifica per diluizione isotopica con standard deuterati, ma richiede più campione, più tempo di sviluppo del metodo e uno strumento dedicato. Nella pratica le due si usano in sequenza: screening immunoenzimatico su serie ampie, conferma e profilo esteso in spettrometria di massa.

Come si conservano gli standard di eicosanoidi?

Sono lipidi polinsaturi e si ossidano: le soluzioni vanno protette da luce e ossigeno, e conservate alle condizioni indicate nel certificato di analisi del lotto, che riporta anche solvente, concentrazione e data di scadenza. Per il dosaggio in spettrometria di massa serve, oltre allo standard non marcato per la curva, il corrispondente analogo deuterato da aggiungere al campione prima dell'estrazione: compensa perdite di estrazione e soppressione ionica. Le miscele pronte di ossilipine servono a verificare tempi di ritenzione e transizioni quando si mette a punto un metodo multi-analita. Un discorso analogo vale per i lipidi bioattivi trattati nella guida agli endocannabinoidi.

Standard e kit a catalogo

Le referenze qui sotto provengono da Cayman Chemical, storicamente specializzata nella chimica dei lipidi, e sono presenti nel catalogo CABRU. L'elenco è parziale: la gamma completa di standard, traccianti, anticorpi e kit ELISA per eicosanoidi e ossilipine si consulta nel catalogo prodotti e nella categoria molecole biochimiche.

Per verificare la referenza adatta alla matrice e alla metodica in uso è sufficiente indicare il codice o l'analita e scrivere a CABRU.